Desarrollo de un ensayo de formación de foco para identificar partículas virales infectantes de virus ZIKA /
Sara Bolívar Marín José , Ricardo Pucciny Cortés
- 66 páginas : figuras ; 13x13cm.
Trabajo de grado (Médicos) -- Universidad Surcolombiana. Facultad de Salud, Programa de Medicina, 2022
Introducción -- Justificación -- Planteamiento del problema -- Antecedentes -- Objetivos -- Objetivo general -- Objetivos específicos -- Marco teórico -- Flavivirus -- Zika virus -- Celulas Vero -- Cultivo celular -- Ensayo de formación de placas -- Ensayos de formación de focos -- Oeracionalización de las variables -- Diseño metodológico -- Tipo de estudio -- Lugar -- Población -- Muestra -- Estrategias para evitar sesgos -- Técnicas y procedimientos para la recolección de datos -- Preparar equipos y reactivos (Día 0) -- Descongelamiento e incubación línea celular vero 76 (Día 0) -- Siembra de células vero 76 del t-75 a placa de 96 pozos (Dia 1) -- Instrumento para la recolección de información -- Prueba piloto -- Codificación y tabulación -- Fuentes de información -- Plan de análisis de los resultados -- Consideraciones éticas -- Resultados -- Discusión -- Conclusión -- Recomendaciones -- Referencias bibliográficas -- Anexos
Introducción: El virus del Zika (ZIKV) codifica una única proteína que posteriormente se procesa en tres proteínas estructurales y siete proteínas no estructurales, de las ultimas la NS1 es la proteína que más se secreta al espacio vascular y sirve como marcador de infección viral. Luego de los brotes de 2013 y 2015 el ZIKV por su relación con microcefalia, síndrome de Guillain-Barré (SGB) y mielitis aguda es declarado por la OMS como una emergencia de salud pública. Por esto, aumentaron el número de investigaciones y se vio la necesidad de conocer el número de partículas infectantes de los stocks usados en diversos experimentos, para lo cual se utilizan diversas técnicas de laboratorio, en nuestro caso se va a utilizar el ensayo de formación de foco, método que utiliza una monocapa de celulas que posterior a la infección viral se fijan y marcan con anticuerpos específicos contra las proteínas virales, para luego ser teñidos y contados.
Objetivo: Desarrollar un ensayo de formación de foco para identificar partículas virales infectantes de Zika
Materiales y métodos: Se cultivaron celulas vero-76 en placa de 96 pozos con medio completo, las celulas fueron infectadas con ZIKV-PR y/o U, fijadas y permeabilizadas con metanol absoluto a -70°C, se agregó el anticuerpo primario, posteriormente el anticuerpo secundario acoplado a biotina, la estreptavidina- peroxidasa y el cromógeno 3-amino9-etilcarbazol, para posteriormente detener la reacción con agua destilada y contar en microscopio de luz invertido. Se evaluó la confluencia de la monocapa y el tiempo de incubación de infección del virus, probándose de 6, 12, 24 y 48 horas, el anticuerpo monoclonal primario se probó el MAb 644 y 130 a diferentes concentraciones (0.3 µg/mL, 0.5 µg/mL,1 µg/mL y 2 µg/mL) y por último la respuesta al inhibidor de la secreción celular brefeldin A.
Resultados: Las celulas infectadas por ZIKV se lograron identificar en monocapa de celulas Vero 76 cultivadas en placa de 96 pozos hasta confluencia del 70%, al momento de la infección con el virus, para lograr confluencia del 100% a las 24h de incubación viral, tiempo propicio para contar los focos de células e impedir la formación de cúmulos de células infectadas. El anticuerpo monoclonal primario más apropiado para el ensayo es MAb 644 a 0.5 µg/mL. Ni el uso de concentraciones ≥ 0.5 µg/mL de anticuerpo primario, ni de Brefeldin A mejoró el conteo de las células infectadas. El número de focos contados por ml en nuestro Stock es a dilución de 10-3 5,08 log 10
Conclusiones: Desarrollamos un protocolo para cuantificar partículas infectantes de ZIKV usando células Vero-76. El ZIKV ahora puede estudiarse en nuestra región utilizando modelos de cultivo celular
Arbovirus
Virus dengue (VD)
Virus Zika
Unidad formadora de foco
Th MD 8353010564 / B689d
Trabajo de grado (Médicos) -- Universidad Surcolombiana. Facultad de Salud, Programa de Medicina, 2022
Introducción -- Justificación -- Planteamiento del problema -- Antecedentes -- Objetivos -- Objetivo general -- Objetivos específicos -- Marco teórico -- Flavivirus -- Zika virus -- Celulas Vero -- Cultivo celular -- Ensayo de formación de placas -- Ensayos de formación de focos -- Oeracionalización de las variables -- Diseño metodológico -- Tipo de estudio -- Lugar -- Población -- Muestra -- Estrategias para evitar sesgos -- Técnicas y procedimientos para la recolección de datos -- Preparar equipos y reactivos (Día 0) -- Descongelamiento e incubación línea celular vero 76 (Día 0) -- Siembra de células vero 76 del t-75 a placa de 96 pozos (Dia 1) -- Instrumento para la recolección de información -- Prueba piloto -- Codificación y tabulación -- Fuentes de información -- Plan de análisis de los resultados -- Consideraciones éticas -- Resultados -- Discusión -- Conclusión -- Recomendaciones -- Referencias bibliográficas -- Anexos
Introducción: El virus del Zika (ZIKV) codifica una única proteína que posteriormente se procesa en tres proteínas estructurales y siete proteínas no estructurales, de las ultimas la NS1 es la proteína que más se secreta al espacio vascular y sirve como marcador de infección viral. Luego de los brotes de 2013 y 2015 el ZIKV por su relación con microcefalia, síndrome de Guillain-Barré (SGB) y mielitis aguda es declarado por la OMS como una emergencia de salud pública. Por esto, aumentaron el número de investigaciones y se vio la necesidad de conocer el número de partículas infectantes de los stocks usados en diversos experimentos, para lo cual se utilizan diversas técnicas de laboratorio, en nuestro caso se va a utilizar el ensayo de formación de foco, método que utiliza una monocapa de celulas que posterior a la infección viral se fijan y marcan con anticuerpos específicos contra las proteínas virales, para luego ser teñidos y contados.
Objetivo: Desarrollar un ensayo de formación de foco para identificar partículas virales infectantes de Zika
Materiales y métodos: Se cultivaron celulas vero-76 en placa de 96 pozos con medio completo, las celulas fueron infectadas con ZIKV-PR y/o U, fijadas y permeabilizadas con metanol absoluto a -70°C, se agregó el anticuerpo primario, posteriormente el anticuerpo secundario acoplado a biotina, la estreptavidina- peroxidasa y el cromógeno 3-amino9-etilcarbazol, para posteriormente detener la reacción con agua destilada y contar en microscopio de luz invertido. Se evaluó la confluencia de la monocapa y el tiempo de incubación de infección del virus, probándose de 6, 12, 24 y 48 horas, el anticuerpo monoclonal primario se probó el MAb 644 y 130 a diferentes concentraciones (0.3 µg/mL, 0.5 µg/mL,1 µg/mL y 2 µg/mL) y por último la respuesta al inhibidor de la secreción celular brefeldin A.
Resultados: Las celulas infectadas por ZIKV se lograron identificar en monocapa de celulas Vero 76 cultivadas en placa de 96 pozos hasta confluencia del 70%, al momento de la infección con el virus, para lograr confluencia del 100% a las 24h de incubación viral, tiempo propicio para contar los focos de células e impedir la formación de cúmulos de células infectadas. El anticuerpo monoclonal primario más apropiado para el ensayo es MAb 644 a 0.5 µg/mL. Ni el uso de concentraciones ≥ 0.5 µg/mL de anticuerpo primario, ni de Brefeldin A mejoró el conteo de las células infectadas. El número de focos contados por ml en nuestro Stock es a dilución de 10-3 5,08 log 10
Conclusiones: Desarrollamos un protocolo para cuantificar partículas infectantes de ZIKV usando células Vero-76. El ZIKV ahora puede estudiarse en nuestra región utilizando modelos de cultivo celular
Arbovirus
Virus dengue (VD)
Virus Zika
Unidad formadora de foco
Th MD 8353010564 / B689d